Видатна роль у заснуванні відділу рукописів, збиранні та зберіганні його фондів належить таким відомим вченим, як В. І. Вернадський, М. П. Василенко, С. О. Єфремов, А. Ю. Кримський.

Основа фонду сформувалася з націоналізованих у період української революції 1917-1920 рр. бібліотечно-рукописних зібрань, матеріалів окремих осіб, які передавали в дар Національній бібліотеці України імені В. І. Вернадського свої колекції та архівні матеріали особових архівів.

Самовідданою працею багатьох археографів та джерелознавців відділу рукописів таких, як Г. П. Житецький, О. М. Олександровський, Ю. П. Діаковський, П. М. Попов, О. А. Назаревський, М. В. Геппенер, К. О. Лазаревська, О. Д. Еттінгер, С. В. Рклицький, К. А. Розенберг, Н. М. Бауер, М. М. Городков, Д. М. Іофанов, М. П. Візир, Й. В. Шубинський, Є. П. Кирилюк, А. Г. Адаменко, О. М. Апанович, С. І. Білокінь, І. Д. Лисоченко, Т. І. Воронкова, О. Й. Ніколаєвська та інших було закладено основи комплектування, археографічного опрацювання та наукового дослідження багатоаспектної рукописної спадщини України.

Нині рукописні фонди складаються з понад 560 тис. одиниць зберігання, з яких понад 8 тис. рукописних книг. Ця рукописна спадщина тисячолітньої історії України в документальних пам'ятках збиралася цілими поколіннями українських державних, релігійних діячів, просвітників, письменників, музикантів і вчених, різними культурними установами та навчальними закладами ХVІІІ-ХХ ст.

Рукописний фонд Інституту рукопису — безцінні колекції рукописних книг грецькою, латинською, арабською, слов'янськими та іншими мовами, що ілюструють розвиток матеріалу письма, різних систем писемності та техніки кодексів різних народів: глиняні клинописні таблички з Месопотамії (поч. ІІІ тис. до н.е.); рукописи з о. Суматра (XVIII ст.), виконані на корі дерева; рукописи на пальмовому листі з Індії та о. Цейлон; тібетські та китайські рукописи різного часу; абіссінські (зараз Ефіопія) рукописи XV і подальших століть; перські та арабські рукописи (переважно, це списки Корану ХІІ-ХІV ст., коментарі, теологічні, юридичні, літературні та філософські твори пізнього середньовіччя); турецька рукописна книга та документи (грамоти султанів) XV-XVIII ст.; вірменські кодекси XIII ст. та уривки з грузинських кодексів різного часу; єврейські рукописні книги та колекція пинкасім, книжкові колекції та єврейські періодичні видання (архів єврейської преси), матеріали фольклорних експедицій 10-40-х років XX ст. та колекція фоноваликів.